SZ nr 94–95/2000z 30 listopada 2000 r.
Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń dróg oddechowych
Urszula Łopaciuk, Danuta Dzierżanowska
Zadaniem diagnostyki mikrobiologicznej jest wykrycie czynnika etiologicznego zakażenia, a w przypadku gdy jest nim bakteria – określenie wrażliwości na antybiotyki. Należy jednak pamiętać, że wykrycie czynnika etiologicznego zakażenia dróg oddechowych jest trudne z racji szerokiego wachlarza patogenów, zarówno wirusowych, jak i bakteryjnych, braku laboratoriów wykrywających te drobnoustroje oraz trudności w uzyskaniu właściwego materiału do badania mikrobiologicznego.
Najczęstsze postacie kliniczne zakażeń dróg oddechowych to:
- przeziębienie,
- zapalenie gardła lub gardła i migdałków,
- zapalenie ucha środkowego,
- zapalenie zatok,
- zapalenie oskrzelików i oskrzeli,
- zapalenie płuc.
Należy pamiętać, że około 90% zakażeń górnych dróg oddechowych ma etiologię wirusową. Wśród wirusów najczęściej odpowiedzialnych za zakażenia w obrębie dróg oddechowych wymienić należy:
- Rhinowirusy – czynnik etiologiczny choroby pospolicie określanej przeziębieniem.
- RSV (respiratory syncylial virus) – odpowiedzialne często za zapalenie płuc i oskrzelików u niemowląt.
- Wirusy grypy – wywołujące grypę, zapalenie płuc, krup.
- Wirusy paragrypy – odpowiedzialne za zapalenie oskrzeli, oskrzelików i płuc.
- Wirus Epsteina-Barr – czynnik etiologiczny ostrego zapalenia gardła i migdałków w mononukleozie zakaźnej.
- Wirusy grupy Herpes – wywołujące zapalenia gardła i zapalenia płuc.
- Adenowirusy – czynnik etiologiczny zapalenia gardła, zapalenia oskrzeli i zakażeń przypominających obrazem klinicznym krztusiec.
Zakażenia dróg oddechowych cechują się wyraźnym wzrostem częstości zachorowań w okresie jesienno-zimowym i zimowo-wiosennym. Sezonowość ta dotyczy zakażeń wirusami paragrypy typu 1 i 2, manifestującymi się objawami krupu: zapaleniem krtani, tchawicy, oskrzeli, szerzącymi się epidemicznie zwłaszcza jesienią. Obok wirusów paragrypy sezonowością charakteryzują się zakażenia wywołane przez wirus RS (respiratory syncytial virus), a zwiększona ich częstość notowana jest późną jesienią, zimą i wczesną wiosną. W regionach o klimacie umiarkowanym szczyt zachorowań występuje od stycznia do marca. Np. w Stanach Zjednoczonych co roku niemal 90 tys. dzieci przyjmowanych jest do szpitali z powodu zakażeń o tej etiologii. Uważa się, że do 12. miesiąca życia 50% wszystkich dzieci przechodzi zakażenie tym wirusem, a do 2. roku życia praktycznie wszystkie dzieci. Powtórne zakażenia wirusem RS występują przez całe życie. Częstość ponownych zakażeń u dzieci w wieku przedszkolnym wynosi 40–70%. U dzieci w wieku szkolnym i dorosłych ryzyko ponownego zakażenia wynosi około 20%. Przebieg ponownego zakażenia jest łagodniejszy, a u większości dzieci tylko jedno zakażenie związane jest z chorobą dolnych dróg oddechowych. Uważa się, że RSV jest przyczyną od 50 do 90% przypadków zapalenia oskrzelików. Z dużo mniejszym, bo około 10% prawdopodobieństwem wirus ten jest przyczyną krupu. Całoroczne zachorowania wywoływane są przez wirus paragrypy typu 3. Podobnie jest w przypadku zakażeń adenowirusowych charakteryzujących się całorocznym cyklem występowania.
Zakażenia górnych dróg oddechowych o etiologii adenowirusowej są trudne do zróżnicowania z paciorkowcowym zapaleniem gardła. Pierwotne zakażenia występują u niemowląt w wieku około 6 miesięcy. Obok typowego zapalenia gardła adenowirusy mogą wywoływać zapalenie oskrzeli i oskrzelików oraz zapalenie płuc. Należy pamiętać, że zakażenia wirusowe mają egzogenny charakter i zawsze źródłem zakażenia jest chory człowiek (dziecko lub dorosły), a zakażenie przenosi się drogą kropelkową wraz z wydychanym powietrzem lub przez bezpośredni kontakt. Najczęściej cząsteczki wirusów przenoszone są przez ręce zanieczyszczone podczas zabiegu czyszczenia nosa. Wydzielina z nosa zakażona RSV pozostaje zakaźna przez ponad 6 godzin. Ciekawostką jest to, że na powierzchni gumowych rękawic wirus ten żyje 1,5 godziny, fartucha – do 30 minut, a na dłoniach przez około 20 minut.
Niewiele ośrodków zajmuje się diagnostyką wirusowych czynników etiologicznych zakażeń dróg oddechowych, co wynika w dużej mierze z faktu, że zakażenia te należą do samoograniczających się, a leczenie polega zazwyczaj jedynie na łagodzeniu objawów choroby. Prowadzone przez ośrodki wirusologiczne badania mają najczęściej na celu charakterystykę antygenową wirusów powodujących zakażenia epidemiczne, np. wirusów grypy. Badania takie dostarczają informacji niezbędnych przy konstruowaniu szczepionek.
Diagnostyka wirusologiczna polega na hodowli wirusów z materiałów klinicznych, najczęściej z popłuczyn z noso-gardzieli. Z uwagi na konieczność stosowania linii komórkowych hodowla jest metodą kosztowną, długotrwałą i prowadzoną jedynie w wyspecjalizowanych ośrodkach. Znacznie większe znaczenie mają badania serologiczne, które pozwalają na wykrycie obecności antygenów wirusowych lub swoistych przeciwciał w surowicy. Badania określające poziom przeciwciał mają wartość diagnostyczną jedynie wówczas, gdy badaniu poddawane są przynajmniej dwie próbki surowicy pobrane w odległym od siebie czasie. Kryterium to pozwala na określenie dynamiki wzrostu bądź spadku miana swoistych przeciwciał, a tym samym – na właściwą interpretację wyniku badania. Metody serologiczne polegające na określeniu poziomu swoistych przeciwciał służą głównie potwierdzeniu postawionej wcześniej diagnozy oraz celom epidemiologicznym.
Dostęp lekarza pierwszego kontaktu do wyspecjalizowanych laboratoriów wirusologicznych jest niewielki, jednak można posiłkować się dostępnymi już od kilku lat w Polsce testami wykonywanymi przy łóżku chorego i wykrywającymi obecność antygenów wirusowych w wymazie z noso-gardzieli. Testy te pozwalają na wykrycie np. antygenów grypy A oraz RSV.
W ostatnich latach coraz szerzej w diagnostyce mikrobiologicznej stosowane są metody biologii molekularnej oparte na polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR); stosuje się je głównie do wykrywania patogenów „nietypowych”, takich jak Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae czy Legionella pneumophila. Drobnoustroje te należą do grupy patogenów bakteryjnych. Podstawową metodą diagnostyczną jest ich hodowla, jednak dla wymienionych bakterii, w odróżnieniu od pozostałych, hodowla jest bardzo trudna, kosztowna i czasochłonna.
Zapalenie gardła i migdałków
Typowym bakteryjnym zakażeniem górnych dróg oddechowych jest paciorkowcowe zapalenie gardła i migdałków. Za 90% wszystkich przypadków odpowiedzialne są paciorkowce grupy A (Streptococcus pyogenes). Warto pamiętać, że tylko paciorkowce grupy A są odpowiedzialne za późne powikłania typu gorączki reumatycznej. Pozostałe drobnoustroje odpowiedzialne za przypadki anginy to: Haemophilus influenzae, maczugowce błonicy czy Borellia vincenti i Fusobacterium. Dwie ostatnie baterie odpowiedzialne są za tzw. anginę Plauta-Vincenta. Choroba ta charakteryzuje się występowaniem szarożółtych nalotów na migdałkach, nieprzyjemnym zapachem z ust i bezgorączkowym przebiegiem. Mikrobiologiczna diagnostyka anginy paciorkowcowej jest prosta i polega na odpowiednim pobraniu wymazu z migdałków i tylnej ściany gardła zmienionych chorobowo, posiewie pobranego materiału na odpowiednie podłoża mikrobiologiczne, hodowli i identyfikacji uzyskanych drobnoustrojów. W czasie pobierania wymazu należy uważać, aby wymazówką nie dotykać języka i błony śluzowej policzka. Pozwala to do minimum ograniczyć kontakt ze śliną zawierającą czynniki hamujące wzrost bakterii. Pobrany materiał należy jak najszybciej dostarczyć do laboratorium, a jeśli to niemożliwe i zachodzi konieczność przechowywania i transportu, wymaz należy pobrać do podłoża transportowego i przechowywać w temperaturze pokojowej. W przypadku właściwie pobranego materiału do badania mikrobiologicznego czułość hodowli wynosi około 90%. Oznacza to, że brak hodowli nie wyklucza całkowicie anginy paciorkowcowej. Bardzo istotną wadą hodowli jest fakt, że nie różnicuje ona zakażenia aktywnego od nosicielstwa u chorego z równoczes-nym zakażeniem wirusowym.
W przypadku wyhodowania paciorkowca grupy A nie ma potrzeby rutynowego oznaczania wrażliwości na penicylinę, bowiem do dzisiaj wszystkie kliniczne szczepy tego drobnoustroju charakteryzują się wrażliwością na ten antybiotyk. Konieczność oznaczenia wrażliwości obowiązuje w przypadku chorego ze stwierdzonym uczuleniem na penicylinę. Należy wówczas oznaczyć wrażliwość na makrolidy lub klindamycynę.
Właściwie wypełnione skierowanie pozwala mikrobiologowi określić tę wrażliwość bez przedłużania czasu oczekiwania na wynik. Konieczność wykonania antybiogramu obowiązuje zawsze w przypadkach, gdy celem pobrania wymazu była kontrola nosicielstwa MRSA, jednak takie założenia dotyczą chorych hospitalizowanych. Lekarz pierwszego kontaktu dysponuje przyłóżkowym testem pozwalającym w pobranym wymazie stwierdzić obecność antygenu paciorkowca grupy A, jednak czułość dostępnych testów jest znacznie niższa niż metod hodowlanych, a ujemny wynik takiego testu nie wyklucza rozpoznania anginy paciorkowcowej.
Warto również pamiętać, że błona śluzowa gardła skolonizowana jest przez całą gamę różnych gatunków bakterii, które tworzą tzw. florę fizjologiczną. Są to zarówno bakterie beztlenowe, głównie ziarenkowce Gram(+) i Gram(-), a także tlenowce, takie jak: Streptococcus viridans, Neisseria sp., koagulazo–ujemne gronkowce, a nawet Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae i Moraxella catarrhalis. Za florę fizjologiczną należy w zasadzie uznać wszystkie drobnoustroje bytujące na błonach śluzowych zdrowego badanego, wiadomo bowiem, że zarówno H. influenzae, S. pneumoniae czy S. pyogenes mogą kolonizować drogi oddechowe, nie powodując objawów zakażenia. Stan ten określany jest bezobjawowym nosicielstwem i występuje zwłaszcza u osób przebywających w większych skupiskach ludzkich (żłobki, przedszkola, domy opieki).
Ochronna rola flory fizjologicznej polega m.in. na nieswoistej stymulacji układu odpornościowego, co w przypadku zakażenia ułatwia syntezę swoistych przeciwciał. Drugą funkcją flory fizjologicznej jest ochrona przed zakażeniami wywołana konkurencją o składniki pokarmowe lub zdolnością syntezy substancji o działaniu bakteriobójczym tzw. bakteriocyn. Niepotrzebne stosowanie antybiotyków prowadzi do zaburzeń ilościowych i jakościowych w składzie fizjologicznej flory bakteryjnej gardła, a w następstwie do kolonizacji błon śluzowych bakteriami potencjalnie patogennymi oraz do selekcji szczepów opornych na antybiotyki.
Ostre zapalenie ucha środkowego
Flora noso-gardzieli może poprzez trąbkę słuchową wnikać do ucha środkowego i wywołać ostre zapalenie ucha środkowego. Wśród bakteryjnych czynników etiologicznych ostrego zapalenia ucha środkowego wymienić należy Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, zdecydowanie rzadziej – Streptococcus pyogenes, a w przypadkach zakażeń przewlekłych – Staphylococcus aureus i bakterie beztlenowe. Jedynym wartościowym materiałem diagnostycznym pozwalającym na określenie czynnika etiologicznego zakażenia jest płyn wysiękowy pobrany w trakcie tympanocentezy lub po samoistnej perforacji błony bębenkowej. Wymienione wcześniej bakterie odgrywające istotną rolę w patogenezie ostrego zapalenia ucha środkowego są bardzo wrażliwe na wahania temperatury i wpływ czynników środowiskowych, należy więc uzyskanemu materiałowi zapewnić odpowiednie warunki przechowywania i transportu, a zwłaszcza nie dopuścić do schłodzenia i wyschnięcia materiału. Trzeba pamiętać o konieczności oznaczenia wrażliwości na antybiotyki wyhodowanych drobnoustrojów, bowiem w grupie czynników etiologicznych zapalenia ucha środkowego może występować oporność. Dotyczy to zwłaszcza oporności na penicylinę Streptococcus pneumoniae.
Zapalenie zatok
Zapalenie zatok obocznych nosa rozwija się jako powikłanie przeziębienia lub wirusowego zapalenia gardła, a część przypadków zakażenia zatok szczękowych ma swoje źródło w ropniach okołowierzchołkowych lub jest następstwem resekcji zęba. Drobnoustroje najczęściej odpowiedzialne za zapalenie zatok to Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, rzadziej pałeczki Gram (-), bakterie beztlenowe (głównie u pacjentów z chorobami zębów) i Staphylococcus aureus. Materiał do badania mikrobiologicznego uzyskać można tylko wówczas, gdy wykonywana jest punkcja zatok. Każdorazowo po wykonaniu punkcji należy wykonać badanie mikrobiologiczne, bowiem żaden inny materiał kliniczny nie jest w tym przypadku odpowiedni. Konieczne jest też oznaczenie wrażliwości na antybiotyki wyizolowanych patogenów z racji występowania szczepów opornych (zwłaszcza Streptococcus pneumoniae). Analiza wyników badań mikrobiologicznych u chorych, którym wykonywano punkcję zatok, pozwala na uzyskanie schematów racjonalnej antybiotykoterapii emiprycznej u większości pacjentów, u których nie wykonuje się punkcji.
Ostre zapalenie oskrzeli
Najczęściej zakażenia te mają etiologię wirusową, uważa się, że w około 80% przypadków. Wśród bakteryjnych czynników etiologicznych ostrego zapalenia oskrzeli wymienić należy Mycoplasma pneumoniae i Chlamydia pneumoniae. Inne bakterie, jak: Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Streptococcus pneumoniae czy Streptococcus b-hemolizujący występują zdecydowanie rzadziej. W ustaleniu czynnika etiologicznego może być pomocne mikrobiologiczne badanie plwociny, jednak właściwe pobranie materiału nastręcza wiele trudności. Wykonanie posiewu plwociny jest zalecane, gdy kaszel utrzymuje się powyżej 3–4 tygodni. Należy też pamiętać, że w przypadku ostrego zapalenia oskrzeli metody hodowlane pozwalają na ustalenie tylko bakteryjnych czynników etiologicznych zakażenia, a te, jak wiadomo, odgrywają zdecydowanie mniejszą rolę.
Zaostrzenie przewlekłego zapalenia oskrzeli
Zakażenie charakterystyczne jest raczej dla dorosłej populacji i dotyczy częściej mężczyzn. W zaostrzeniach przewlekłego zapalenia oskrzeli największą rolę odgrywają patogeny wirusowe (około 64% przypadków). Wśród bakterii najistotniejszą rolę odgrywają Streptococcus pneumoniae i Haemophilus influenzae. Do badań mikrobiologicznych najczęściej pobiera się plwocinę, jednak wartość diagnostyczna tych badań jest wątpliwa; pacjenci z przewlekłym zapaleniem oskrzeli są zazwyczaj skolonizowani wymienionymi bakteriami, ich izolacja z plwociny nie musi więc wskazywać na aktualny proces zapalny.
Zapalenie płuc
Wśród czynników etiologicznych zapalenia płuc ważną rolę odgrywają wirusy, jednak w tej postaci zakażenia dróg oddechowych duże znaczenie mają też bakterie. Z bakteryjnych czynników etiologicznych ambulatoryjnego zapalenia płuc najważniejsze są Streptococcus pneumoniae i Mycoplasma pneumoniae. W dalszej kolejności wymienić należy otoczkowe szczepy Haemophilus influenzae (H. influenzae typu B), Streptococcus pyogenes i Staphylococcus aureus. Te same czynniki etiologiczne odpowiedzialne są za wczesne szpitalne zapalenie płuc. Szpitalne zapalenia płuc późne u chorych wentylowanych powodują najczęściej pałeczki Gram (-) z rodziny Enterobacteriaceae oraz niefermentujące z rodzajów Acinetobacter i Pseudomonas. Bakterie te cechują się opornością na wiele antybiotyków, co zdecydowanie utrudnia leczenie tych zakażeń. Najlepszym materiałem do badania mikrobiologicznego są popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe, a wykonanie badania ilościowego pozwala ocenić rolę poszczególnych izolowanych drobnoustrojów w etiologii zapalenia.
W diagnostyce zakażeń dolnych dróg oddechowych materiałem może być plwocina, aspirat śródtchawiczy, popłuczyny oskrzelowe, materiał uzyskany w trakcie bronchoskopii, płyn pęcherzykowo-oskrzelowy czy krew. Dyskutowana jest ciągle wartość diagnostyczna mikrobiologicznego badania plwociny, trudno bowiem ocenić, czy badany materiał na pewno pochodzi z oskrzeli. Na zwiększenie wiarygodności wyników uzyskanych z posiewu plwociny istotny wpływ ma sposób jej pobrania. Należy to zrobić rano po umyciu zębów i dokładnym wypłukaniu jamy ustnej w celu zmniejszenia liczby drobnoustrojów kolonizujących jamę ustną. Plwocinę należy odkrztusić do jałowego pojemnika i dokładnie go zamknąć. Zaleca się też podanie leku mukolitycznego, żeby ułatwić odkrztuszenie głęboko zalegającej wydzieliny.
Wiarygodnym materiałem do badań mikrobiologicznych są aspiraty śródtchawicze. Materiał pobiera się, wprowadzając igłę pomiędzy chrząstkę przyścienną a tarczową po wcześniejszym znieczuleniu i dokładnym odkażeniu skóry. Przez igłę wprowadzany jest cewnik do dolnego odcinka tchawicy. Zawartość należy zaaspirować strzykawką z założonym drenem, a w przypadku skąpej wydzieliny można wprowadzić niewielką objętość jałowej wody. Metoda ta jest z racji swojej inwazyjności stosowana jedynie w razie bezwzględnej konieczności i przez fachowy personel.
Istotnym diagnostycznie materiałem są popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe pobrane podczas bronchofiberoskopii. Tak pobrany materiał można poddać badaniu ilościowemu, które pozwoli ocenić stosunki ilościowe poszczególnych drobnoustrojów w przypadku izolacji kilku różnych gatunków. Ma to szczególne znaczenie w diagnostyce zakażeń dolnych dróg oddechowych u chorych hospitalizowanych w oddziałach intensywnej terapii. Wydzielinę oskrzelową można również pobrać za pomocą fabrycznie przygotowanego jałowego zestawu złożonego z przymocowanej do kaniuli osłoniętej szczoteczki, jedak zestawy te są ciągle jeszcze kosztowne.
W przypadku zakażeń dróg oddechowych przebiegających z wysoką gorączką istotne znaczenie diagnostyczne ma posiew krwi. Uważa się, że u chorych z pneumokokowym zapaleniem płuc w około 20% przypadków Streptococcus pneumoniae izolowany jest z krwi. Należy pamiętać również, że krew jest materiałem diagnostycznym w kierunku gruźlicy. Przy pobieraniu krwi na posiew trzeba spełnić kilka podstawowych elementów. Konieczne jest zdezynfekowanie skóry chorego i korka butelki z podłożem płynnym w celu uniknięcia zanieczyszczeń ze skóry. Butelki z podłożem przed pobraniem do nich materiału należy ogrzać, gdyż drobnoustroje najczęściej odpowiedzialne za zapalenia płuc są wrażliwe na wahania temperatury. Nie można również z tego samego powodu dopuścić do schłodzenia pobranego już materiału. Optymalnym momentem do pobrania posiewu krwi jest około pół godziny przed szczytem temperatury, gdyż jest to moment najwyższej bakteriemii. Należy również pamiętać o konieczności pobrania więcej niż jednej próbki. Uznaje się też, że pobieranie więcej niż pięciu posiewów w ciągu doby nie zwiększa znacząco szansy uzyskania wzrostu bakterii.
Po uzyskaniu hodowli bakterii na podłożach stałych konieczne jest oznaczenie ich wrażliwości na antybiotyki oraz wrażliwości na penicylinę dla Streptococcus pneumoniae, a w przypadku uzyskania szczepu opornego należy oznaczyć wartość MIC (minimalne stężenie hamujące) dla penicyliny. Szczepy oporne na penicylinę charakteryzują się też czasami opornością na III generację cefalosporyn.
Częstość występowania penicylinoopornych Streptococcus pneumoniae jest różna dla różnych regionów Polski i niezbędne jest jej oznaczanie w przypadku każdorazowej izolacji Streptococcus pneumoniae. Rutynowo oznacza się też wrażliwość na antybiotyki szczepów Haemophilus influenzae, chociaż w Polsce odsetek Haemophilus influenzae produkujących b-laktamazy jest niewielki i oscyluje w granicach 4%. Należy również pamiętać, że około 90% szczepów Moraxella catarrhalis syntetyzuje b-laktamazy. Znajomość tych danych pozwala na wdrożenie właściwej antybiotykoterapii.
Odrębnych metod diagnostycznych wymagają zakażenia drobnoustrojami nietypowymi, jak Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae czy Legionella pneumophila. Hodowlę tych bakterii prowadzą tylko nieliczne laboratoria naukowe, natomiast pomocne mogą tu być badania serologiczne wykrywające obecność antygenów bakteryjnych w materiale klinicznym lub określające miano swoistych przeciwciał w surowicy. Dostępne obecnie testy pozwalają wykryć antygeny Legionella pneumophila np. w moczu bez konieczności inwazyjnego pobierania materiału do badań. Testy te wykonywane są przez personel laboratoryjny. W serologicznej diagnostyce zakażeń Chlamydia pneumoniae stosowany jest test mikrofluorescencji, gdzie określane są miana przeciwciał w klasie IgG, IgM i IgA. Ostre zakażenia rozpoznaje się na podstawie 4-krotnego wzrostu miana przeciwciał w stosunku do pierwszej próbki, obecności przeciwciał klasy IgM w mianie 1:16 lub IgG w mianie 1:512 lub więcej. Należy pamiętać, że w ostrym zakażeniu pierwotnym przeciwciała klasy IgM pojawiają się po około 3 tygodniach od pierwszych objawów zakażenia, zaś IgG po około 6–8 tygodniach. Przy reinfekacjach zazwyczaj nie ma odpowiedzi w klasie IgM, natomiast przeciwciała klasy IgG pojawiają się już po 2 tygodniach.
Diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń dróg oddechowych jest wyjątkowo trudna. Materiał kliniczny niezbędny do badań jest trudno dostępny, a poza tym nie każda pracownia wykonuje wszystkie niezbędne badania. Dane dotyczące wyników badań pochodzą w dużej mierze z krajów anglosaskich. Pomimo kwestionowania wartości badań mikrobiologicznych w diagnostyce zakażeń dróg oddechowych należy je wykonywać. Badania takie mają na celu także monitorowanie odsetka szczepów opornych na poszczególne antybiotyki, co pozwala prowadzić racjonalną politykę antybiotykową w przypadku zakażenia.